ЗАПИСЬ НА ЗАНЯТИЯ — В ТЕЛЕГРАМ-КАНАЛЕ «БИОЛОГИЯ У СУРЕНА» →

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
ИНТЕРАКТИВНО

1 молекула ДНК → интерфаза (S) → 2 одинаковые молекулы · к теории ↓
материнская цепьновая ДНКРНК-праймер

Шаги репликации

    ТЕОРИЯ: ДНК И РЕПЛИКАЦИЯ

    всё, что нужно к ЕГЭ — от нуклеотида до теломер

    01Нуклеиновые кислоты

    ДНК

    Дезоксирибонуклеиновая кислота — полимер, мономером которого является дезоксирибонуклеотид.

    Он состоит из:

    • азотистого основания (А, Т, Г, Ц);
    • пятиуглеродного сахара дезоксирибозы;
    • остатка фосфорной кислоты.
    РНК

    Рибонуклеиновая кислота — полимер, мономером которого является рибонуклеотид.

    Он состоит из:

    • азотистого основания (А, У, Г, Ц);
    • пятиуглеродного сахара рибозы;
    • остатка фосфорной кислоты.
    Строение нуклеотида ДНК и РНК: фосфатная группа, пентозный сахар, азотистое основание
    Нуклеотид = фосфатная группа + пентоза (дезоксирибоза в ДНК, рибоза в РНК) + азотистое основание. В РНК вместо тимина — урацил.

    02Строение ДНК

    Основные характеристики:

    1. Нерегулярный гетерополимер (состоит из разных мономеров, которые чередуются хаотично).
    2. Имеет вид правозакрученной двойной спирали.
    3. Цепи комплементарны и антипараллельны (против 3′-конца одной цепи находится 5′-конец другой).
    4. Диаметр двойной спирали ДНК — 2 нм.
    5. Расстояние между соседними нуклеотидами — 0,34 нм.
    6. На один оборот спирали приходится 10 пар нуклеотидов (1 виток = 3,4 нм).
    Комплементарные антипараллельные цепи ДНК с 5′- и 3′-концами
    Цепи антипараллельны: 5′-конец одной напротив 3′-конца другой
    Двойная спираль ДНК: диаметр 2 нм, виток 3,4 нм = 10 пар нуклеотидов
    Д — остаток дезоксирибозы, Ф — остаток фосфорной кислоты

    03Азотистые основания

    Пуриновые (два кольца): аденин, гуанин.

    Пиримидиновые (одно кольцо): цитозин, урацил, тимин.

    В любом фрагменте ДНК содержание остатков гуанина всегда точно соответствует содержанию цитозина, а аденина — тимину (правило Чаргаффа).
    А + Ц = Т + Г
    Структурные формулы пуриновых и пиримидиновых оснований
    Пуриновые и пиримидиновые основания

    04Уровни структуры ДНК

    Первичная структура

    Представляет собой линейную последовательность нуклеотидов, которые соединены друг с другом ковалентными связями. Ковалентные связи образуются между сахарами и фосфатами (фосфодиэфирные связи), таким образом формируется сахарофосфатный остов, к которому прикреплены азотистые основания.

    Сахарофосфатный остов и азотистые основания
    Сахарофосфатный остов цепи ДНК
    Фосфодиэфирная связь между 3′ и 5′ атомами углерода
    Фосфодиэфирная связь соединяет 3′-C одного сахара и 5′-C следующего

    Вторичная структура

    Представляет собой двойную спираль. Нити ДНК соединены друг с другом с помощью водородных связей (между А и Т две связи, между Г и Ц — три связи). Азотистые основания обращены внутрь двойной спирали, а сахарофосфатный остов — наружу.

    Водородные связи: А–Т две, Г–Ц три
    А=Т — две водородные связи, Г≡Ц — три
    Двойная спираль с большой и малой бороздками
    Большая и малая бороздки, сахарофосфатный остов снаружи
    Розалинд Франклин и Фотография 51
    Фотография 51, полученная Розалинд Франклин с помощью рентгеноструктурного анализа, позволила выявить трёхмерную атомарную структуру молекулы ДНК.

    При повышении температуры водородные связи между цепями начинают разрушаться и происходит денатурация (или плавление) ДНК.

    Для денатурации цепи, в которой много А и Т, потребуется меньше энергии, чем для цепи, в которой больше Г и Ц, так как между А и Т меньше водородных связей.

    Денатурация и ренатурация ДНК

    Третичная структура

    Цепь ДНК, намотанная на белки-гистоны. ДНК, связанная с гистонами, формирует нуклеосому. Каждая нуклеосома состоит из 4 пар гистонов. Вокруг одной нуклеосомной частицы ДНК делает 2,5 оборота. Гистоны — положительно заряженные белки (обладают щелочными свойствами), взаимодействующие с отрицательно заряженной цепью ДНК (обладает кислыми свойствами). Укладка ДНК в нуклеосомную нить повышает плотность её упаковки в 7 раз.

    Нуклеосомы: 8 гистонов и 146 пар нуклеотидов, линкерная ДНК
    Нуклеосомный комплекс: 8 гистонов + 146 пар нуклеотидов ДНК

    Четвертичная структура

    Представляет собой наивысшую форму организации ДНК — хроматин и его суперспирализованную форму, хромосомы.

    Уровни упаковки ДНК от 2 нм до метафазной хромосомы 1400 нм
    ДНК 2 нм → нуклеосома 11 нм → фибрилла 30 нм → «соленоид» 300 нм → нить 700 нм → метафазная хромосома 1400 нм

    05Функции ДНК

    1. Образует хромосомы (в результате спирализации самой на себя с помощью белков-гистонов).
    2. Хранение и передача наследственной информации, генетического кода.
    3. Кодирует первичную структуру белка.
    4. Участвует в биосинтезе РНК и белков (является матрицей).

    06Репликация (редупликация, удвоение) ДНК. Инициация

    Происходит в интерфазе (перед делением клетки). Включает в себя 3 стадии: 1. Инициация, 2. Элонгация, 3. Терминация.

    При инициации двойная спираль расплетается, образуется репликативная вилка.

    Расплетение двойной спирали ДНК хеликазами→Связывание SSB-белков с одиночными нитями ДНК→Синтез праймера

    Репликация начинается в точках начала репликации — ориджинах. В каждой точке начала репликации формируются две репликативные вилки (осуществляется двунаправленная репликация).

    Репликон — единица процесса репликации, находящаяся под контролем одного ориджина.

    Расхождение цепей в точке начала репликации
    Цепи двойной спирали разъединяются при помощи белков-инициаторов
    Монорепликонный механизм у прокариот

    1 репликон. Начало репликации — точка origin (ori).

    Полирепликонный механизм у эукариот

    Около 1000 репликонов в 1 молекуле ДНК.

    Монорепликонный механизм у прокариот и полирепликонный у эукариот
    Слева — кольцевая хромосома бактерии (1 репликон), справа — хромосома эукариот (много репликонов)

    Последовательность инициации

    • Хеликаза (геликаза) связывается с ориджином и начинает раскручивать и расплетать двойную спираль ДНК в двух направлениях. Образуются две репликативные вилки.
    • Сформировавшиеся одноцепочечные участки ДНК удерживаются с помощью SSB-белков (ДНК-связывающие белки). Эти белки препятствуют обратному соединению цепей между собой.
    • Топоизомеразы (ДНК-гиразы) находятся перед репликативной вилкой. Они делают небольшие разрезы, снимая возникающее торсионное напряжение (облегчают раскручивание цепи ДНК хеликазами).
    • Синтез «затравки» (РНК-праймера) ферментом праймазой (РНК-полимераза). Без праймера синтез ДНК начаться не сможет, так как ДНК-полимераза синтезирует цепи ДНК, присоединяя нуклеотиды к свободной 3′-ОН группе уже существующей цепи (вот как раз к праймеру и будут присоединяться нуклеотиды новой цепи ДНК).

    07Элонгация

    Происходит синтез лидирующей и отстающей цепей ДНК с помощью ДНК-полимеразы, которая начинает синтез с праймера.

    Репликативная вилка: топоизомераза, хеликаза, SSB, праймеры, ДНК-полимераза, фрагменты Оказаки
    Репликативная вилка
    ДНК-полимераза движется по матричной цепи от 3′-конца к 5′-концу (а новая цепь растёт в направлении 5′→3′). Поэтому на одной цепи синтез происходит непрерывно (лидирующая), а на другой — прерывисто, фрагментами Оказаки (отстающая цепь).
    Репликационный глазок с двумя вилками и фрагментами Оказаки
    Репликационный глазок: две вилки движутся в разные стороны
    Лидирующая и отстающая цепи относительно направления движения вилки
    Лидирующая и отстающая (фрагменты Оказаки) цепи

    Фрагменты Оказаки между собой потом будет сшивать ДНК-лигаза. Она образует между фрагментами фосфодиэфирную связь.

    Подписанная схема репликации: 11 структур
    1 — отстающая цепь; 2 — лидирующая цепь; 3 — ДНК-полимераза; 4 — лигаза; 5 — праймер; 6 — праймаза; 7 — фрагмент Оказаки; 8 — ДНК-полимераза; 9 — хеликаза/геликаза; 10 — SSB-белки; 11 — топоизомераза

    08Терминация. Проблема концевой недорепликации

    Терминация — остановка синтеза ДНК.

    У прокариот происходит в результате встречи репликативных вилок. Она возможна за счёт того, что ДНК имеет кольцевую форму.

    У эукариот терминация происходит при столкновении вилок, движущихся в противоположных направлениях, и при достижении конца хромосомы.

    Репликация кольцевой ДНК прокариот
    Репликация кольцевой ДНК бактерии

    Проблема терминации у эукариот

    ДНК-полимераза осуществляет синтез дочерней цепи ДНК путём её достраивания с 3′-конца. Когда она доходит до конца хромосомы, она не может полностью реплицировать 3′-конец родительской цепи. Праймер, который присоединён к концу, удаляется. Но на месте праймера не получается достроить цепь ДНК, так как там нет 3′-конца.

    Укорочение дочерних молекул после удаления концевого праймера
    После удаления концевого РНК-праймера дочерние молекулы всё короче и короче

    В результате с каждым делением хромосомы укорачиваются. Но клетка эукариот выработала специальную защиту от такого укорачивания. На концах хромосом содержатся участки, не содержащие генов, — теломеры. С каждым циклом репликации теломеры укорачиваются. Теломеры короче в соматических клетках взрослых людей (так как они поделились уже много раз). Есть теломеразная теория старения, суть которой в том, что укорочение теломер связано с процессом старения организма.

    Укорочение теломер с каждым клеточным делением
    Когда теломеры укорочены, клеточное деление останавливается
    Теломеры синтезируются особым ферментом теломеразой. В большинстве соматических клеток она неактивна. Высокая активность теломераз наблюдается в стволовых клетках, лейкоцитах, гаметах, опухолевых клетках.
    Репликация ДНК у эукариот происходит гораздо медленнее, чем у прокариот. Это объясняется большей степенью конденсации (упаковки) ДНК в хромосомах, а также более сложной и тщательной «проверкой» правильности синтезируемой дочерней цепи специальными репарирующими системами. Репарация ДНК — исправление ошибок, возникающих во время репликации (и не только).

    Проблема меньшей скорости репликации ДНК у эукариот решается наличием множества репликонов (полирепликонный механизм).

    09Принципы репликации ДНК

    1. Комплементарность (матричность) — новая цепь молекулы ДНК будет синтезироваться по одной из старых цепей по принципу комплементарности (А комплементарен Т, Г комплементарен Ц).
    2. Антипараллельность — две цепи ДНК антипараллельны (одна цепь заканчивается ОН-группой у 3′-конца, другая — остатком фосфорной кислоты у 5′-конца).
    3. Полуконсервативность — образуются 2 дочерние спирали, одна из которых сохраняет в неизменном виде одну из половин материнской ДНК.
    4. Челночный синтез (полунепрерывность) — ДНК-полимераза движется в направлении от 3′ к 5′ (направленность). Формируются лидирующая и отстающая цепь.
    5. Требует наличия «затравки» — РНК-праймера.

    10Гипотезы репликации. Опыт Мезельсона и Сталя

    Консервативная, полуконсервативная и дисперсная репликация
    Три гипотезы: консервативная, полуконсервативная, дисперсная

    Процесс репликации ДНК полуконсервативен. Это доказали М. Мезельсон и Ф. Сталь с помощью своего эксперимента.

    • Они выращивали бактерии кишечной палочки на среде с тяжёлым изотопом азота ¹⁵N (метод меченых атомов). Поскольку в ДНК имеются азотистые основания, для их построения бактерии брали тяжёлый изотоп азота ¹⁵N из питательной среды. В результате их ДНК стала тяжёлой.
    • Затем бактерии пересадили на среду с лёгким изотопом азота ¹⁴N. Один образец был отобран после первой репликации, а другой — после второй репликации. После чего измеряли плотность ДНК (и, косвенно, содержание в ней изотопов ¹⁴N и ¹⁵N), используя центрифугирование в градиенте плотности.
    Пробирки: тяжёлая, гибридная и лёгкая ДНК
    «Тяжёлая» (¹⁵N), «гибридная» (¹⁴N, ¹⁵N) и «лёгкая» (¹⁴N) ДНК после центрифугирования
    Консервативный механизм

    ДНК дочерних клеток 1-го поколения должна была разделиться на две фракции (50% лёгкая и 50% тяжёлая). ДНК клеток 2-го поколения — тоже на две фракции (75% лёгкая и 25% тяжёлая). Этого не произошло.

    Дисперсный механизм

    ДНК должна была быть гибридной во всех поколениях. Этого также не произошло.

    При полуконсервативном механизме ДНК дочерних клеток 1-го поколения должна была быть гибридной. ДНК дочерних клеток 2-го поколения должна разделиться на 2 фракции (50% гибридная, 50% лёгкая). Так и получилось на практике. И в каждом последующем поколении бактерий процент гибридной ДНК уменьшался, а процент лёгкой ДНК возрастал.
    Результаты по поколениям 0–4: доли лёгкой и гибридной ДНК
    Поколения 0–4: 100% → 50/50 → 75/25 → 88/12 (лёгкая/гибридная)
    Схема опытов Мезельсона и Сталя
    Схема опытов Мезельсона и Сталя, доказывающих полуконсервативность репликации ДНК